Translezyonel DNA sentezi nedir?

Translezyon DNA sentezi olgusu (Translesion DNA sentezi – hasar yoluyla DNA sentezi) olgusu, ne yazık ki çok fazla kapsanmamaktadır. Moleküler biyoloji ders kitapları genellikle bundan bahsetmemektedir. Ayrıca bu konuda çok sayıda bilimsel makale olduğunu söylemeye gerek yoktur. Yukarıdaki gerçeklere rağmen TLS, her şeyden önce hücre genomunun bütünlüğünü ve stabilitesini korumak için gerekli olan çok önemli bir süreçtir. Mevcut durumla bağlantılı olarak yazar, kendisine göründüğü gibi belirsiz ama çok önemli bir konuya ışık tutmak istemektedir. Bu derlemede hem bu sürecin temel yönlerini sunmaya, hem de çalışmanın uygulamalı tarafına değinmeye çalıştığımız yazımız aşağıdadır. Ayrıca makalenin başlığında sorulan soruya (bir ölçüde felsefi) cevap verilmeye çalışılmıştır.

Translezyonel DNA sentezi nedir?

Görünüşe göre, hücrelerimizin DNA şeklinde sunulan genetik materyali, kalıtsal bilgilerin yavru hücrelere en doğru şekilde aktarılmasını sağlamak için süper kararlı bir yapı olmalıdır. En mantıklısı ise, zamanla meydana gelmektedir. Ancak, gerçekte birkaç nüans vardır. Hücre DNA’sının sadece bir günde on binlerce farklı hasara uğramasına inanmak zordur. Bu nedenle onarım sistemlerimiz vardır. Genel olarak her şey ilk bakışta göründüğü kadar basit değildir.

Tabii ki, onarım sistemleri vardır. Ayrıca bunlardan birkaçı var ve hepsi farklı mekanizmalara göre çalışmaktadır. Ancak hasarın çeşitliliğini ve bunlara neden olan faktörleri hayal etmek zordur. Genel olarak, DNA hasarı hem dış (dışsal), hem de iç (endojen) faktörlerin sonucu olabilmektedir.

En önemli dışsal faktörler arasında ultraviyole (UV) radyasyonu, iyonlaştırıcı radyasyon (IR) ve DNA’yı değiştiren çeşitli (sayısız olan) kimyasal maddeler bulunmaktadır. Ayrıca hücresel solunum, lipid peroksidasyonu, hatalı replikasyon ve bazların kendiliğinden deaminasyonu gibi hemen hemen her organizmanın hücrelerinin içinde meydana gelen bu tür süreçler ve bir grup endojen faktör oluşturmaktadır.

“DNA hasarı” ve “mutasyon” kavramlarını birbirinden ayırmak önemlidir. DNA hasarı genellikle, DNA’nın birincil yapısında, hala orijinal durumuna geri döndürülebilen böyle bir değişiklik olarak anlaşılmaktadır. Mutasyon ise, DNA’nın birincil yapısında yavru hücrelere aktarılacak kalıcı ve geri döndürülemez bir değişikliktir. Bu nedenle, DNA hasarı potansiyel bir mutasyondur. Bu yazıda temel olarak gen düzeyinde meydana gelen (genomik mutasyonlarla karıştırılmaması gereken) mutasyonlardan bahsedeceğiz. Ayrıca kromozomal yeniden düzenlemelere de değineceğiz.

Hasar çekişmesi

Hasar türleri ve görünümlerine katkıda bulunan faktörler hakkında, en azından ayrı bir inceleme yazılabilmektedir. Ancak kendimizi sadece kısa bir açıklama ile sınırlayacağız.

Kısa analizimize en “popüler” lezyon olan apurin/apirimidin bölgesi (AP bölgesi) ile başlıyoruz. AP bölgesinin yapısı, kelimenin tam anlamıyla çıplak bir şeker-fosfat “iskeleti” olarak bilinmektedir. Azotlu bir bazdan yoksun bir fosfat grubu ile deoksiribozdur. Ayrıca onu kaybetmek zor değildir. Bununla birlikte şeker arasındaki N-glikosidik bağı kırmak yeterlidir. Bu hasarların çoğu tam olarak hücrede meydana gelen en yaygın fizyolojik süreçlerin bir sonucu olarak ortaya çıkmaktadır.

Oksidatif hasar da DNA hasarının yapısındaki ana yerlerden birini işgal etmektedir. Ana suçlular, elektronların solunum zinciri boyunca taşınması sırasında üretilen, aktivitesiyle biz ve diğer birçok organizmanın enerji aldığı yan ürünlerdir. Başka bir deyişle, solunum gibi fizyolojik bir süreç, DNA’ya zarar veren reaktif oksijen türlerinin oluşmasının nedenidir. Guanin çoğunlukla 8-oksoguanin ve türevlerini oluşturmak üzere oksitlenmektedir. Timidin glikol ve 5-metilsitosinin çeşitli oksitlenmiş “varyantları” daha az tehlikeli hasarlar değildir.

Yüksek düzeyde mutajenik lezyonlar, esas olarak UV radyasyonunun nükleik asitler tarafından absorplanması nedeniyle ortaya çıkan fotoürünlerdir. Bunlara siklobütan pirimidin dimerleri ve (6-4) fotoürünler de dahildir. UV radyasyonunun özelliği, bitişik timinlerin dimerizasyonu, aralarında kovalent bir çapraz bağ oluşturma yeteneğinden kaynaklanmaktadır.

Türleri

Alkilleyici ajanların etkisinin neden olduğu hasar türlerinin sayısını hesaplamak zordur. Çünkü azotlu bazlar (Ayrıca alkillenebilecekleri birçok bölge vardır) potansiyel olarak çok çeşitli kimyasallar tarafından, özellikle eksojen bir kimyasal tarafından değiştirilebilmektedir. Yukarıdaki hasar kanserde kemoterapinin neden olduğu hasar olarak söylenebilmektedir. Ayrıca N6-etenoadenin, deamine bazlar, tek ve çift zincirli DNA kırıkları da örnek olarak söylenebilmektedir. Liste neredeyse sonsuzdur. Çok fazla zarar türü vardır. Ayrıca her birinin kendi yolunda benzersiz olduğu söylenebilmektedir. Bununla birlikte, evrim zor bir iştir. Hemen hemen her hasar için orijinal DNA yapısını restore etmeye yardımcı olacak şu veya bu enzimatik sistem vardır.

Etyolojiye ve hasarın tipine göre değişiklik gösterebilmektedir. Ayrıca hücre döngüsünün fazına bağlı olarak, bir veya daha fazla onarım yolu aktive edilmektedir. Çoğu onarım mekanizmasının hem prokaryotlarda, hem de ökaryotlarda kullanılan yüksek oranda korunmuş süreçler olduğunu belirtmekte fayda vardır. Elbette aralarında farklılıklar da vardır. Ancak genel olarak mekanizmalar çok benzemektedir.

Hücre döngüsü

Bir veya başka bir onarım sisteminin aktivasyonunun hücre döngüsünün fazına bağlı olduğu gerçeği, boşuna değildir. Onarıcı sistemlerin çoğu, hücre döngüsünün sentetik (S) aşamasının dışında veya aslında oldukça mantıklı olan erken aşamalarında etkinleştirilmektedir. Hücrenin genetik materyalinin iki katına çıkması S fazında gerçekleştiğinden, hücrenin sadece DNA hasarını oluşmadan önce “onarması” için zamana ihtiyacı vardır. Böylece mutasyona uğramazlar ve genomda sabitlenmezler.

Bununla birlikte bazı nedenlerden dolayı DNA hasarı, varsayımsal olarak hoş olmayan sonuçlara yol açabilecek onarım sistemlerinden kaçabilmektedir. Örneğin, nükleotid eksizyon onarımı için öncelik, (6-4) fotoürünlerin onarımıdır. Belirli bir miktarda siklobutan pirimidin dimerleri, S fazına göç etmektedir. İnsan genomunun hala oldukça büyük olduğunu ve bazen birkaç onarıcı sistemin bile DNA’ya zarar veren ajanların tüm sonuçlarını ortadan kaldırmak için yeterli olmadığını hatırlatmak da önemlidir.

Hücresel DNA replikasyondan önce “yaralarını iyileştirmeyi” başaramazsa ne yapılmalıdır?

Onarım sistemleri tarafından birleştirilmeyenleri yanıtlayacağım. Çünkü onlar “DNA hasar yanıtı” (DNA hasar yanıtı, DDR) olarak adlandırılan daha genel, daha “hacimli” bir metabolik yolun yalnızca bir parçasıdır. Çeşitli onarım yollarına ek olarak DNA hasar yanıtı, DNA hasar toleransı (DDT) yolunu da içerebilmektedir. Tabii ki, örneğin S fazının aşamasında, homolog rekombinasyon çalışmaktadır. Ancak “alt tabakası” ağırlıklı olarak çift iplik kopmalarıdır. Peki ya diğer hasar türleri nelerdir? İşte burada TLS’yi etkinleştiren, DDT imdada yetişmektedir. Nasıl çalıştığını anlamak için, daha önce birkaç kez bahsedilen çoğaltma işlemine biraz dalmanız gerekmektedir.

Çoğaltma

Çoğaltmanın nasıl başlatıldığı, nasıl düzenlendiği ve bu çok yönlü sürecin diğer incelikleri üzerinde durmayacağız. Yine de, size DNA replikasyonunun temel yönlerini hatırlatmama izin verin. Ek olarak, DNA polimerazlar gibi replizomun bu tür anahtar bileşenlerine odaklanmayı öneriyorum. 1957’de, DNA polimeraz (daha sonra ortaya çıktığı gibi, tek başına olmaktan çok uzaktır) ilk olarak Amerikalı bilim adamı Arthur Kornberg tarafından E. coli’den izole edilmiştir. Ayrıca bu sınıftaki enzimlerin çalışmasının başlangıcını ve genel olarak replikasyonu işaret etmişlerdir.

Hemen ertesi yıl ise, Meselson ve Stahl’ın parlak deneyleri, esası yarı muhafazakar doğası olan kopyalamanın temel ilkelerini ortaya çıkarmayı mümkün kılmıştır. Ancak, şu anda bildiğimiz replikasyon modeli ve replikasyon çatalı, ancak 30 yıldan fazla bir süre sonra önerilmiştir. Yine de söylenmesi gerekir ki, günümüzde küçük değişiklikler geçirmiştir. Diğer replikatif DNA polimerazların keşifleri de yapılmıştır. Böylece, üç DNA polimeraz, Pol α, Pol δ ve Pol ε, ökaryotik nükleer DNA replikasyonunda yer almaktadır. Ayrıca hayvanların mitokondriyal DNA’sının replikasyonu için ayrı bir enzim amaçlanmıştır – Pol γ.

DNA polimerazları

Elbette DNA polimerazları, DNA replikasyonundaki tek katılımcı olmaktan çok uzaktır. “Oyuna girmeden” önce, genellikle DNA’nın ori noktaları adı verilen özel bölgelerinde meydana gelen replikasyonun kendisi başlatılmalıdır. Bu tür sitelerde, önce çoğaltma çatallarının oluşumu gerçekleşmektedir. Ayrıca onları oluşturmak için ihtiyacınız olan şunlardır;

• (a) bu alandaki bir bölgeyi denatüre edin (her iki zincirin bazları arasındaki hidrojen bağlarını koparın);
• (b) bu ​​bölgeye, 5′ → 3′ yönünde zıt yönlerde hareket ederken DNA’yı çözecek olan sarmalları yükleyin. (elbette, zincir antiparalelliği ilkesini gözlemleyerek), iki replikasyon çatalının oluşumuyla sonuçlanacaktır;
• (c) tek iplikli DNA’yı özel proteinlere bağlayarak stabilize etmektedir. Ayrıca DNA’nın çözülmesinden dolayı çatalın önünde oluşan topolojik gerilimi azaltmaktadıır.

Ancak yukarıdaki olaylardan sonra, DNA polimerazlar “hazırlanmış toprağa” gelmektedir. Bu nedenle de sonuç olarak, bütün bir protein topluluğu oluşmaktadır. Bu topluluğun adı ise, “replisom” olarak bilinmektedir.

Şimdi en ilgincine geçiyoruz. Çoğaltmanın nihayet başlatıldığını, replisome adı verilen hantal “makinenin” toplandığını ve çoğaltma çatalının yolculuğuna ori noktasından başladığını hayal edin. Aniden tam rotada, hasarı fark edilecektir. Onarım sistemlerinden mucizevi bir şekilde kurtulan aynı hasar meydana gelecektir.

Peki hasarla karşılaştığınızda ne olacaktır?

En yaygın sonuç, çoğaltma çatalının durmasıdır. Başka bir deyişle, çatal basitçe hasar yerinde durmakta ve ilerleyememektedir. Bu durum replikatif strese yol açacaktır. Şu anda bilim bu fenomenin çeşitli sonuçlarını bilmektedir. Ancak eksik replikasyon apoptozu tetikleyebilmektedir.

Birkaç eylemde trajedi

DNA hasarı ve aslında eksik / kesintili replikasyonla dolu en gizemli sonuçlardan hala bahsetmedik. Her şeyden önce, hasar potansiyel bir mutasyondur. Ancak mutasyonlar farklıdır. Tek baz ikamesi (SNP) anlamına gelen ifadenin vücut üzerinde ciddi bir etkisi olmaması muhtemeldir. Ancak bu ifade oldukça tartışmalıdır. Çoğu, mutasyonun lokalizasyonuna bağlıdır. Yani hangi gende ve onun hangi bölgesinde “kırılma” meydana gelecektir. Böyle bir değişikliğin farklı bir amino asidin kodlanmasına yol açıp açmayacağını ve cevap evet ise hangisinin olduğunu anlamak da aynı derecede önemlidir. Genel olarak, böyle bir mutasyon meydana geldiğinde birçok nüans vardır. Ayrıca hücreye ve bir bütün olarak organizmaya zarar vereceği gerçeğinden uzaktır.

Mutasyonların tamamen farklı bir düzeye (kromozomal düzeye) ulaşması çok daha korkunçtur. Bir çoğaltma çatalı takılırsa, hücre onu stabilize etmek için diğer yolları etkinleştirmeye çalışacaktır. Ne yazık ki, böyle bir girişim her zaman başarılı değildir. Bu durumda, çatal çökecektir. Ancak burada bile, diğer onarım mekanizmalarının sorunu çözmeye yardımcı olabileceği bir “B planı” vardır. Bununla birlikte, eylemleri son derece “özensiz” olduğundan, kullanımları büyük bir risk ile ilişkilidir. Sonuç olarak, büyük olasılıkla hücre için bir gen mutasyonundan çok daha fazla tehlike taşıyan ciddi kromozomal yeniden düzenlemeler meydana gelmektedir. Bu tür kromozomal kararsızlık, programlanmış ölümüne ve apoptoza yol açan bir dizi reaksiyonun aktivasyonuna bile yol açabilmektedir.

Replikatif DNA polimerazında

Sebepler, her şeyden önce, replikatif DNA polimerazında veya daha doğrusu yapısında yatmaktadır. Genel olarak, hemen hemen her DNA polimerazın yapısını tanımlamak için, araştırmacılar sıklıkla insan sağ eli ile karşılaştırmasına başvururlar. Yazara göründüğü gibi çok sıra dışı bir benzetmedir. Gerçekte, DNA polimerazların yapılarına ne kadar bakarsa baksın, kişisel olarak burada bir el görmesi çok zordur. Herhangi bir enzim, aktif bölge adı verilen bir bölge içermektedir. Ayrıca polimerazlar istisna değildir. Bununla birlikte DNA polimerazın türünden bağımsız olarak hepsi yaklaşık olarak aynı prensibe göre çalışmaktadır.

Aktif bölge hem substrat bağlanmasını, hem de katalizini sağlamaktadır. Aslında enzimin polimeraz aktivitesinden sorumlu olan DNA polimerazların katalitik çekirdeği, genellikle aralarında çeşitli fonksiyonların dağıtıldığı üç alanın bir kombinasyonundan oluşturmaktadır. Reaksiyon, doğrudan Palm alanı (avuç içi) tarafından katalize edilirken, diğer alanlar, Parmaklar ve Başparmak substrat bağlanmasının retansiyonunu gerçekleştirmektedir.

Büyüyen zincir DNA’sının şablonu ve bağlanması.

Yaklaşık olarak yarı açık sağ el, polimeraz reaksiyonunun uygulanması için gerekli olan yukarıda belirtilen “bileşenleri” kucaklıyor gibi görünmektedir.

Ancak replikatif polimerazların “çevresinin” çok spesifik olduğu söylenmelidir. Bu alanlar tarafından tanımlanan uzay sınırlı bir konfigürasyona sahiptir. Öyle ki, enzim kendi içine sadece tamamlayıcı nükleotidleri (nadir istisnalar dışında) itebilmektedir. Ayrıca eğer bu çok nadir olay meydana gelirse, cephaneliklerinde yanlış yerleştirilmiş bir nükleotidi tanıyan ve “ısıran” bir eksonükleaz alanı olan başka bir özel alan vardır. Bu kendi kendini düzeltme mekanizmasının (düzeltme okuması) arkasında 3’→5′ eksonükleaz aktivitesi vardır.

Şablon nükleotidin karşısına dNTP’ler dahil edildiğinde yüksek seçicilik sağlayan “katı” aktif bölge, 3’→5′-düzeltme aktivitesi de ortaya çıkmaktadır. Ayrıca yapının evrim sırasında değişmeden kalmasını sağlayan son derece yüksek muhafazakarlık, “üç sütun”dur. Yüksek hassasiyetli genom replikasyonu neredeyse her organizmaya dayanmaktadır. Ancak madalyonun bir de diğer yüzü daha vardır. Aynı zamanda, başta aktif bölgenin konformasyonu olmak üzere bu aynı özellikler, bu enzimlerin DNA çift sarmalının bozulmasına neden olan hasarlı bölgeleri kopyalamasına izin vermemektedir. Enzimin aktif bölgesi tarafından belirlenen geometriye de uymazlar. Bu nedenle görünüşe göre konumuzdaki o çok gizemli “kahramanlar”, replikatif polimerazların “kuzenleri” hakkında konuşmanın zamanı gelmiştir. Son derece uzmanlaşmış bu enzimler, translezyonel DNA polimerazlar olarak bilinmektedir

Translezyonel DNA polimerazlar

Yani, translezyon sentezinin DNA polimerazları veya basitçe translezyon DNA polimerazlarıdır. Aslında, isimleri İngilizce’den çok “konuşan”. trans – geçiş, lezyon – hasar olarak çervrilmektedir. Onları bu kadar benzersiz yapan nedir? Evet, aynı aktif site Translezyonel DNA polimerazın hasarın karşısına bir nükleotidi yerleştirmesine izin veren özellikleridir. Evrim sürecinde, aktif bölgeleri ve bir bütün olarak yapı, enzimlerin TLS’ye katılması nedeniyle bazı değişiklikler geçirmişlerdir.

Kanonik TLS DNA polimerazları, Y ailesinin enzimlerinin yanı sıra B ailesinden Pol ζ olup, fark etmiş olabileceğiniz gibi, yüksek kaliteli replikatif DNA polimerazlarının çoğunu içermektedir. A ailesinden (Pol γ hariç) ve X ailesinden enzimler biraz farklı şeyler için uzmanlaşmıştır. Ancak TLS’ye de katılabilmektelerdir. En azından in vitro, bu kesin tiptir. Ek olarak, başka DNA polimeraz aileleri de vardır. Örneğin, üyeleri bakteriyel replikatif DNA polimerazları olan C ailesi ve arke enzimlerini içeren D ailesidir. Ters transkriptazların “yaşadığı” RT ailesi de ayırt edilmektedir. Ancak biz tabloda sunulan ailelerin ökaryotik üyelerine odaklanacağız.

Sınıflandırma

Sınıflandırmayı çözdük gibi görünmektedir. Ancak şimdi yapısı polimeraz tarafından çeşitli DNA hasarlarının geçişine göre uyarlanmış aktif merkezlerinin özelliklerine geçebiliriz. Çok fazla hasar varyantı olduğundan, türlerinde uzmanlaşmış en az birkaç TLS DNA polimerazı vardır. Genellikle aktif bölgelerinin DNA şablon zincirinde hasara karşı yüksek bir “toleransa” sahip olduğu söylenmektedir.

Translezyonel DNA polimerazlarının aktif merkezi, replikatif karşılıklarıyla tam olarak aynı işlevleri yerine getiren, zaten bilinen Avuç içi, Parmaklar ve Başparmak alanlarından oluşmaktadır. Buna göre, “sağ elin” ortak özellikleri olan mimarisi korunmuştur. Ancak, önemli farklılıklar vardır. Bu nedenle, translezyonel DNA polimerazların sırasıyla primer ve şablon iplikle başparmak ve parmaklarını oluşturan temas sayısı, replikatif akrabalara kıyasla çok daha azdır. Bu nedenle, aktif sitenin “kapasitesi” artmaktadır. Bu da içindeki matris hasarını bulmayı mümkün kılmaktadır. Daha az önemli olmayan ikinci fark, Y ailesinin temsilcilerinde Küçük Parmak alanının varlığıdır. Bu enzimlerin dar uzmanlaşmasını belirleyen en önemli faktör bu alandır. Polimerazla ilişkili alan (PAD) olarak da adlandırılmaktadır. Ayrıca bu alan, matris ile ek temaslar oluşturduğu için önemlidir. Böylece, Fingers alanının, şablon hasarlı nükleotidi enzimin aktif bölgesinde konumlandırmasına yardımcı olmaktadır. Bu özelliklerden dolayı modifiye edilmiş aktif bölge, hasarlı DNA bölgeleri ile reaksiyonu katalize edebilmektedir. Öyle ya da böyle, TLS sürecinin kendisi neye benzemektedir?

“Alternatif” çoğaltma

TLS’yi doğrudan başlatan anahtar olay, DNA hasarına yanıt olarak meydana gelen, 164 pozisyonundaki lizinde PCNA (çoğalan hücre nükleer antijeni) proteininin translasyon sonrası modifikasyonudur (yani, her yerde bulunur). PCNA öncelikle bir homotrimerdir (yani üç özdeş molekülden oluşmaktadır). Genel olarak, bu bir halka gibidir. Replikatif polimerazların matrise güvenilir bir şekilde bağlanması nedeniyle çift sarmallı DNA sarmalının etrafını saran bir kayar kelepçedir. Ayrıca diğer moleküller için moleküler koordinatör olarak görev yapan bir tür “platform”dur. Aslında rolü replikasyon ve TLS’nin çok ötesine geçmektedir. Ayrıca bunun hakkında çok uzun uzun konuşabiliriz ama biz TLS’deki işlevlerine odaklanacağız.

Kendi içinde, PCNA ubiquitination, birçok faktöre bağlı olan çok karmaşık bir şekilde düzenlenmiş bir mekanizmadır. Hücre döngüsü kontrol noktalarının geçişi ve buna bağlı olarak aşaması, DNA hasarının türü, DTT ile ilişkili diğer yolların aktivasyonu ve ayrıca bazılarını içermektedir. Daha fazla araştırma gerektiren diğer faktörler ise, “Asılı” ubiquitin, RAD18 ve RAD6’dan oluşan bir kompleks tarafından katalize edilmektedir. Tabii ki, RAD18/RAD6 alımı ve PCNA modifikasyonu olaylarından önce, en az birkaç proteinin dahil olduğu, zaten TLS’nin kapsamının biraz ötesinde olan bir dizi reaksiyon ile gelmektedir.

Peki, her yerde bulunan PCNA formu ne yapmaktadır?

Birinci senaryo

Her şeyden önce, gizemli enzimlerimizi sıkışmış replikasyon çatalına çekilmektedir. Ayrıca bu aşamada görevleri replikatif polimerazlarla yer değiştirmektir. Bu nedenle burada sorular ortaya çıkmaktadır. Bu nasıl ve hangi koşullar altında olmaktadır. Ayrıca hiç değişiyorlar mıdır? Bu bağlamda, TLS’nin devam edeceği olası senaryoları tanımlayan birkaç model önerilmiştir.

İlk ve belki de en çok çalışılan polimeraz değiştirme modeli olarak adlandırılmaktadır. Genellikle iki polimeraz modeli olarak adlandırılır. Modifiye edilmiş PCNA’nın translezyonel polimerazları replikasyon çatalına aldığını zaten bulunmuştur. Bir sonraki adım, polimerazların değişimidir. Rev1’in, replikatif polimerazın yerini alan ve PCNA’ya bağlanan ilk aktive edilen olduğuna inanılmaktadır. Rev1, protein-protein etkileşimlerine aracılık eden birçok özel düzenleyici bölge ve bağlanma yeri ile donatılmıştır. Yani PCNA ve zaten kendisine bağlanan diğer TLS DNA polimerazları arasında dilerseniz bir tür “aracı”, “hub” görevi görmektedir. Başka bir deyişle, Rev1 adı verilen “platform”, öncelikle katalitik olmayan özellikleri nedeniyle oldukça değerlidir. Sonunda, düzenleyici proteinler ve birkaç translezyonel DNA polimerazından oluşan bir kompleks, translesome oluşmaktadır. Ayrıca günümüzde model her iki adını da haklı çıkarmaya başlamaktadır.

Bu nedenle, ilk polimerazın görevi, hasarın karşısına bir nükleotidi yerleştirmektir. Bu hedef tamamlandıktan sonra, hasardan sonra zinciri uzatan ve şablon zincirin hasarsız bazlarının karşısına belirli sayıda (büyük ölçüde değişen) nükleotidler ekleyen başka bir translezyonel polimeraza geçiş meydana gelmektedir. Şu veya bu TLS DNA polimerazının üstlendiği göreve uygun olarak, bir yerleştirici polimeraz ve bir genişletici polimeraz izole edilmektedir. Sonuç olarak, her şey normale dönmekte ve replikomdaki replikatif DNA polimeraz, çeşitli tehlikeler ve engellerle dolu büyüleyici yolculuğuna devam etmektedir.

İkinci senaryo

İkinci senaryo ise polimerazlar arasında bir değişiklik olmamasıdır. Daha doğrusu, resmi olarak gerçekleşmemesidir. Ancak ilk durumda replikatif polimerazlar, replizomu geçici olarak bırakarak yerlerine “yol veriyor” gibi görünüyorsa, o zaman bu modelde replikatif ve oldukça özelleşmiş polimerazların birbirleriyle içlerinde “bir arada var olduğu” varsayılmaktadır. Ayrıca bunların hepsinin PCNA ve tüm bu proteinleri “barındırabilen” yapısı sayesinde olduğu bir versiyon ileri sürülmüştür. Görünüşe göre, kalan adımlar iki polimeraz modeline göre benzer şekilde gerçekleşmektedir.

Buna son olarak, tamamen farklı ilkelere dayanan üçüncü model de vardır. Yukarıda açıklanan modeller doğrudan S fazında meydana gelen replikasyon süreciyle ilgilidir. O zaman burada olayların gelişimi ya hemen sonunda ya da zaten G2 fazında başlamaktadır. Replisome hasar görür görmez faaliyetini geçici olarak durdurmaktadır. Buna göre, hasarın karşısında ve zaten arkasında bir “delik” kalmaktadır. Yani hasar alanının ötesinde, PrimPol enzimi bir primeri yeniden sentezlemektedir. Bunun sadece bir polimeraz değil, aynı zamanda bir primaz olduğunu unutmamak gerekmektedir. Ayrıca ribonükleotitleri değil, “yapı taşları!” olarak deoksinükleotitleri kullanmaktadır. Hangi replikatif polimerazlar çalışmasına devam eden replisome’un bir parçası olarak tamamlanacaktır. Bu olaya ise, yeniden hazırlama denmektedir. Ayrıca replisome çalışmasının sonunda (veya hasarlı bölgeden çok uzakta olduğunda), mecazi olarak “boşluğu yamalayan” (dolayısıyla adı – boşluk) bu alana translezyon polimerazları çekilmektedir. Bu bir doldurma modeldir. Çoğaltma sonrası onarımın bir tür versiyonu olarak ortaya çıkmaktadır. Ancak böyle bir hikaye de vardır.

Tabii ki, hala birçok boşluk vardır. İn vivo süreç nasıl gerçekleşmektedir? TLS DNA polimerazları her iki zincirde de işlev görebilir mi? Bu süreci en doğru şekilde tanımlayan model hangisidir? Ve cevaplarını almak istediğim, eşit derecede önemli daha birçok soru daha vardır.

Hayatta kalmak ne pahasınadır?

TLS ve ilgili moleküllerin incelenmesi, temel bilimin “temsilcileri” tarafından yürütülmektedir. Bununla birlikte, temel bilimin soruları zaman içinde sorunsuz bir şekilde uygulamalı problemlere akabilmektedir. Bu nedenle, cevap doğru olacaktır. TLS analizi önemli bir iştir. Aslında böyle bir ifade hemen hemen her molekül / metabolik yol / genel olarak oluşum için doğru olacaktır. Araştırmacılar için belirlenen bazı görevleri çözmede zaten belirli başarıların olduğunu güvenle söyleyebilmek mümkündür. Ancak TLS gibi temel bir işlemin incelenmesinin bize nasıl yardımcı olabileceği sorusuna daha detaylı ve kesin bir cevap verebilmek için translezyonel DNA polimerazlarına dönmek gerekmektedir.

Daha önce anladığımız gibi TLS, onarım sistemlerine bir alternatif değildir. Onlar için son derece önemli bir uygulamadır. Bu, replikasyon çatalının DNA’nın hasarlı alanlarını geçmesine yardımcı olan tamamen farklı bir metabolik yoldur. Ancak, bazen TLS aktivasyonunun daha sonra maliyetli olabileceği görülmektedir. Peki bir hücrenin çoğalmaya devam etmesi ve hayatta kalması için ödenmesi gereken bedel tam olarak nedir?

Translezyonel DNA polimerazlar

Translezyonel DNA polimerazlar, başta iki şekilde olmak üzere çeşitli hasarları barındırabilen değiştirilmiş aktif bölge için ödenmiştir. Ayrıca ilki doğruluktur. Bu terim, doğru nükleotidin dahil edilme sıklığının, yanlış olanın eklenme sıklığına oranını ifade etmektedir. İkincisi, işlemsellik, polimerazın şablon ipliğe her bağlandığında büyüyen primer ipliğe ekleyebildiği nükleotidlerin sayısını ifade etmektedir. Bu göstergenin, tüm replikasyon boyunca enzimin şablonla afinitesini koruma yeteneğini karakterize ettiğini söyleyebiliriz.

Replikatif DNA polimerazlar hem aslına uygunluk, hem de işlenebilirlik için yüksek değerlere sahiptir. Yüksek doğruluklarını sağlayan replikatif DNA polimerazların özelliklerini zaten tartışmıştık. Başka bir özelliğe gelince şablona bir tur bağlamada, birkaç yüz bin kadar nükleotid ekleyebilmektedir. Bu yüksek değerler, aşağıdaki faktörler nedeniyle elde edilmektedir;

• Enzimin matrise güçlü bağlanmasını sağlayan katalitik olmayan alt birimler;
• Bir kelepçe gibi DNA moleküllerinin etrafına sıkıca sarılmış bir kelepçe;
• Şablon zincirine ek “bağ” sağlayan benzersiz alanlar (örneğin, Pol e mayasındaki P alanı);
• Ek proteinler (RPA, RFC, vb.).

Translezyonel polimerazlar hem doğruluk, hem de işlenebilirlik açısından son derece düşük oranlarla karakterize edilecektir. Bunun tek istisnası, Y ailesinin enzimlerine kıyasla artan bir işlenebilirliğe sahip olan Pol ζ’dir. Ancak, yine de bu açıdan hala “kardeşlerinden” uzaktır. Bu özellik, onu bir genişletici polimeraz rolü için mükemmel bir aday yapmaktadır. Düşük işlenebilirliğe sahip TLS polimerazlar ise yerleştiricilerin rolü için çok uygundur. Görünüşe göre TLS adlı bir tiyatro için “oyuncular” bulmuşlardır.

Katılımları için ne isteyeceklerdir?

Tabii ki hiçbir şey istemeyecekler. Ancak “oyunlarından” son derece nahoş “yan etkiler” oluşacaktır. Mutasyonları önlemek ve genomun stabilitesini korumak yerine, kendileri önemli bir olasılıkla, zaten kırılgan olan genomik “dengeyi” altüst ederek onlara katkıda bulunabilirler. Bunun sebebi, muhtemelen tahmin ettiğiniz gibi, son derece düşük doğruluklarında yatmaktadır. Böylece bu makalenin “kahramanları” anti-kahramanlara dönüşmektedir. Sorunlarla başa çıkmak için tasarlanmış enzimler genellikle onları kendileri yaratmaktadır.

Öte yandan, hücre için daha büyük kötülük ne olacaktır?

Gen seviyesindeki birkaç mutasyon (bunlar çoğunlukla tek nükleotid yer değiştirmeleridir) veya majör kromozomal yeniden düzenlemelerdir (veya belki de tamamlanmamış replikasyon sonucu hücre ölümü). Açıkçası ikincisi genel olarak, “iki kötülük arasında seçim yapmama” seçeneğine sahip olmak güzel olurdu, ama elimizde ne varsa bizde de vardır.

Doğruluk

Son derece düşük doğruluk ile kastedilen, bozulmamış şablonlar üzerinde (in vitro yeniden üretilen reaksiyonlarda) bile çalışırken, translezyon polimerazlarının sıklıkla hata yapmasıdır. Böyle bir “ıskalama”, yaklaşık olarak her 10-1000 nükleotidde bir meydana gelmektedir. Ki bu, replikatif polimerazlara kıyasla birkaç kat daha yüksektir. Gerçekten hasarlı matrisler için böyle bir olasılığın daha az olmadığını söylemek gerekli midir?

Her zamanki gibi, enzimin aktif bölgesi suçludur. Sadece şablon hasarına değil, aynı zamanda geometrisi nedeniyle gelen nükleotide de “toleranslıdır”. Çok seçici değildir. Ancak ortaya polimeraz çıkmaktadır. Bazen o kadar “okunmaz” ki, bir ribonükleotidi bir matris deoksiribonükleotidi ile bile eşleştirebilmektedir. Ayrıca, bazı translezyonel polimerazlarda (örneğin, Pol ℩), aktif merkez o kadar dar bir şekle sahiptir ki, kelimenin tam anlamıyla şablon nükleotidi kendisine “olağandışı” bir konformasyon almaya zorlamaktadır. Böylece gelen nükleotit ile hidrojen bağları oluşturabilmektedir. Ayrıca bu tür bağlar zaten kural dışı olacaktır. Bu arada, kanonik olmayan etkileşimlerin kullanılması, DNA hasarı olan bir bölgeden geçerken kullanılan TLS polimeraz stratejilerinden bir diğeridir. Güreşte her yol mübahtır.

Ayrıca bir nüans daha vardır. Replikatif polimerazlarda bulunan aynı eksonükleaz alanını içermektedir. TLS polimerazlarda basitçe yoktur (Pol ζ buna sahip olmasına rağmen aktif değildir). Evrim nedense bu küçük ama çok önemli özellikten kurtulmayı uygun görmüştür. Belki TLS sürecinde saniyeler de önemlidir. Ayrıca replikasyon çatalının olağan işini yapmaya devam edebilmesi için hasarın mümkün olan en kısa sürede geçmesini sağlamak için translesiyon polimerazları gerektirmektedir. Ayrıca bu hedefe ne pahasına ulaşılmaktadır. Onun için görünüşe göre, bu çok önemli bir konu değildir.

TLS’nin ötesinde

Aslında, translesyonellerin işlevleri TLS’nin sınırlarının çok ötesine geçmektedir. DNA ile ilişkili çeşitli süreçlerde önemli yerleri işgal ederek hücrenin yaşamında aktif olarak yer alırlar. Ayrıca bazen daha yoğun bir mutasyon birikimine katkıda bulunan aşırı düşük doğruluk gibi zayıflıklar bile, hücrenin kendi yararına kullanabilmesidir.

Örneğin, Y DNA polimeraz ailesinin hemen hemen tüm üyelerinin, vücuttaki antikor çeşitliliğinin altında yatan immünoglobulin genlerinin somatik hipermutajenezi sürecinde önemli bir rol oynadığı bulunmuştur. Bu durum, onların “becerilerinin” işe yaradığı yerdir. Çünkü yalnızca bağışıklık sisteminin B hücrelerindeki ağır ve hafif immünoglobulin zincirlerinin değişken bölgelerinde mutasyon “yapmaları” gerekmektedir.

Ancak liste bununla sınırlı değildir. Ek olarak, çoğu kromozomların kırılgan bölgeleri gibi replikasyonu zor olan (replikatif polimerazlar için) bu tür bölgelerin kopyalanmasıyla ilgilidir. Onkogenler ve tümör baskılayıcı genler sıklıkla bu tekrardan zengin bölgelerde lokalize olduğundan, burada olabildiğince dikkatli olmaları gerekmektedir.

Translezyon polimerazları, mikro uydular gibi diğer dizilere yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Bu bölgelerin kararsızlığının, kanonik olmayan bir dizi DNA formunun oluşumuna neden olabileceğine dikkat edilmelidir. Z-DNA, H-DNA, G-dörtlüler ve diğerleri buna dahildir. Bu arada TLS DNA polimerazları, neredeyse tüm Y ailesi tarafından ikincisinin replikasyonunda yer almaktadır.

Yukarıdaki işlemler, ağırlıklı olarak sadece DNA polimeraz aktivitesi gerektirmektedir. Ek aktivitelerin (örneğin, 5′-deoksiribofosfat liyaz) ve yapısal özelliklerin varlığına bağlıdır. Muhtemelen onların BER, c-NHEJ ve alt-EJ gibi onarıcı süreçlere katılmalarına izin vermektedir. Öyle ya da böyle, çoğalmayan birçok DNA polimerazın cephaneliğinde, onları anlamamızı büyük ölçüde genişleten inanılmaz “güçler” vardır. Gördüğünüz gibi, sadece TLS ile sınırlı, çok dar uzmanlar olmadığı ortaya çıkmıştır.

“Kusurlu” polimerazlardaki kusurlar

Replikasyon yapmayan DNA polimerazları kodlayan genlerdeki mutasyonların ve polimorfizmlerin sonuçları çoğu durumda memeliler için öldürücü değildir. Öyle ya da böyle, burada bozukluğun hangi belirli gende ortaya çıktığına bağlıdır. Ayrıca TLS DNA polimerazın hangi yapısal bölgesini etkileyeceği bir bağımlılık vardır. En açıklayıcı örnek, enzim aktivitesinin kaybına yol açan POLN genindeki (sırasıyla Pol η kodlayan) mutasyonlardır. Bu polimerazın ana işlevi, UV’nin zararlı etkilerinden kaynaklanan fotoürünlerin deri hücrelerinin genomu üzerindeki geçişidir. Bu nedenle, vücudun bu tür radyasyona karşı koruması keskin bir şekilde düşürmektedir. Bu kanser öncesi duruma kseroderma pigmentosum da denmektedir.

Yakın zamanda, REV3L genindeki bozukluklar ile Möbius sendromunun gelişimi yetersiz olmaktadır. Bu durum beslenme ile birlikte gelişimsel gecikme ve bir dizi başka belirti ile karakterize edilen bir hastalık arasında ilginç bir ilişki bulunmuştur.

Teorik olarak, kanser ve yukarıdaki hastalıklara ek olarak, translezyon polimerazlarındaki mutasyonlar, patogenezinde kilit konumlardan biridir. Ayrıca “trinükleotit tekrarlarının genişlemesi” olarak adlandırılan bir madde ile işgal edildiği bazı nörodejeneratif hastalıkların gelişmesine yol açabilmektedir.

Denge neden bu kadar önemlidir?

Evet, bir yandan TLS kullanma ücreti yüksektir. Diğer yandan hücre hayatta kalmaktadır. Görünüşe göre onun adına mutlu olabilirsin. Ama kesinlikle sözde kritik mutasyonların birikmesi sonucu kötü huylu hale gelmesi durumunda sürücü genleri yoktur. Elbette, translezyonel DNA polimerazın, tam da böyle bir genin bir kısmını kopyalayarak oluştuğu bilinmektedir. Ayrıca şablon olanın karşısına yanlış bir nükleotidi sokacağı kesin olmaktan uzaktır. Bununla birlikte hiç kimse, özellikle aktivite ve ifadelerindeki değişiklik koşullarında bundan bağışık değildir.

Translezyonel DNA polimerazların ekspresyonunun düzenlenmesindeki çeşitli rahatsızlıklar hayatımızı büyük ölçüde karmaşıklaştırabilmektedir. Aynı zamanda tümör hücreleri için hayatı kolaylaştırmaktadır. Bir hücre bu enzimlerin ekspresyonu ve aktivitesi üzerindeki kontrolünü kaybettiğinde, bu vücut için üzücü sonuçlar doğurmaktadır. Sonuçta, hücrelerimizdeki hasarın geçişinden sorumlularsa, kanser hücrelerinde en azından aynı şeyi yaptıklarını varsaymak mantıklıdır.

Bu konuda birkaç durum ise şu şekildedir;

• Normal hücrelerde yetersiz ifade. Her şey açık görünmektedir. TLS yolu sırasıyla daha az dahil olacaktır. Ayrıca hücre DNA’ya zarar veren ajanlara karşı daha duyarlı hale gelecektir. En iyi durumda ve replikasyon sürecinde, hasarla karşı karşıya kaldığında, hücre tek bir nükleotid ikamesi şeklinde “hafif bir korku” ile inecektir. Bununla birlikte diğer TLS DNA polimerazları, zayıf bir şekilde eksprese edilen bir enzimi yerini alabilmektedir. Ancak diğer hasarlardaki uzmanlıkları doğruluk katmamaktadır. En kötü ihtimalle büyük kromozomal yeniden düzenlemeler almakta veya tamamen apoptat olmaktadır.
• Normal hücrelerde aşırı ekspresyon/aktivite. Bunun sadece translezyonel polimerazların daha sık kullanılmasının bir sonucu olarak mutajenezi teşvik etmesi mantıklıdır. Bu arada daha önce bildiğimiz gibi, bozulmamış DNA bölümlerinin replikasyonu sürecinde de yer alabilmektedir. Bu da şu anlama gelmektedir; normal bir hücre için bu durum iyi olarak adlandırılamamaktadır.
• Kanser hücrelerinde aşırı ekspresyon/aktivite. Çoğu durumda, bu onlar için uygun bir durumdur. “Bu neden tümör hücresi için iyi midir? okuyucu soracaktır.” Sonuçta, bu yolun kullanımının mutasyonların ortaya çıkmasıyla ilişkili olduğunu açıkladık.
• Kanser hücrelerinde yetersiz ekspresyon/aktivite. Aslında, bu durum çok belirsizdir. Çünkü bu fenomen ile mutajenez sıklığındaki değişiklikler ve kemoterapi ilaçlarına direnç arasındaki ilişki, bu tür hücrelerde her zaman izlenmemektedir. Genellikle bu durum, hangi DNA polimerazın yetersiz ifade edildiğine bağlıdır.

Hormalar üzerinde etkisi

Açıkçası, kanser hücrelerinde TLS DNA polimerazlarının aşırı ekspresyonunun baskılanması, bunların kemoterapötik ilaçlara karşı direncini azaltabilmektedir. Çok sık olarak, bu tür inhibitörlerin rolü, 18-25 bp uzunluğunda, kodlama yapmayan kısa tek iplikli RNA’lar olan küçük RNA’ların bir sınıfı veya daha doğrusu bunların alt tipi mikroRNA’lar (miRNA’lar) olarak kabul edilmektedir. Hedef mRNA’nın 3′-çevrilmemiş bölgesindeki bir diziye bağlanarak, ürünün daha fazla translasyonunu bloke etmektedir. Ayrıca bizim durumumuzda, belirli bir DNA polimeraz da bulunmaktadır.

Elbette, bu makalenin “suçlularının” ifadesini/faaliyetini etkilemenin tek yolu bu değildir. Başka bir strateji olarak, zaten bitmiş bir ürünü bağlamayı deneyebilirsiniz. Enzimin kendisi, böylece translesome ile etkileşimini bozabilmektedir. Tarama, in silico yöntemler ve hücre kültürleri üzerinde yapılan deneyler sonucunda, birkaç potansiyel düşük moleküler ağırlıklı bileşik tanımlanmıştır. Bir başka umut verici yön, proteinleri seçici olarak bağlayan RNA ve DNA aptamerlerinin sentezidir.

Şu anda, polimerazların bu özelliklerini etkileyen bileşikler esas olarak in vitro çalışılmaktadır. Başka bir deyişle klinik öncesi denemelerden geçmektedir. Bununla birlikte, 2020’nin sonu itibariyle Pol θ inhibitörleri için ilk klinik denemelerin 2021’de başlamış olması gerekirdi. Ayrıca, DNA polimerazların çeşitli özellikleri (örneğin, ekspresyonlarının seviyesi, polimorfizmlerin varlığı) doktorlar için önemli olan bazı prognostik değerlere bile sahip olabilmektedir.

Sonuç olarak;

Umarım temel süreçlerin ve bu süreçlerin hangi mekanizmalara göre ilerlediğinin incelenmesinin neden önemli bir nokta olduğunu açıklayabilmişimdir. Tabii ki, bu aşamada, birçoğunun etkinliği sadece in vitro gösterildiğinden, yukarıdaki bileşiklerin klinik kullanımı hakkında konuşmak için çok erkendir. Ayrıca, TLS’de yer alan DNA polimerazlara ek olarak, düzensizlikleri daha da üzücü sonuçlara yol açabilecek çok sayıda başka proteinin de olduğunun hepimiz farkındayızdır. Bununla birlikte, TLS DNA polimerazlarının aktivitesini ve ekspresyonunu etkileyen hedeflenen terapötik ajanların araştırılması, tanımlanması, geliştirilmesi ve modifikasyonunu içermektedir. Belki de şu anda en önemli hedef değildir. Ancak çok umut verici bir yöndür ve geliştirilmesi oldukça umut vericidir.

Translezyonel sentez yolunu her seferinde, genellikle mutasyonlar pahasına aktive eden bir hücre, hayatta kalma fırsatını yakalamaktadır. Bu eşit bir değişim midir? Şahsen, bu soruya cevap vermekte zorlanıyorum. Muhtemelen, hücrenin kendisi için burada ve şimdi karlı bir “anlaşma” dır. Bir bütün olarak vücut için kesin olarak söylemek mümkün değildir. Ancak bunu sadece zaman gösterecektir.